1845’te toplanan Maarif Komisyonunun kararıyla devlet dairelerine memur yetiştirmek gayesiyle, bir Dârülfünûn açılması çalışmalarına başlanmıştır. Ayasofya’da eski Cebehâne Kışlası ile Sultan Saraylarının arsasına, üç katlı ve yüz yirmi beş odalı bir bina tahsis edildi. Mekteb-i Hukuk'un kuruluşuna kadar eğitim hizmetlerinde ve devlet işlerinde kullanılan bu binada, idadî ve rüştiyelerden sonra, 14 Ocak 1863’te Dârülfünûn öğretimi başladı. Laboratuarı ve çok geniş bir kütüphanesi olan Dârülfünûn’da, Kimyâger Derviş Paşa, Ahmed Cevdet Paşa, Ahmed Vefik Paşa, Hekim Salih Paşa ve Müneccim Osman Efendi gibi, devrin kıymetli ilim adamları ders veriyorlardı.

1865’te, Çemberlitaş semtinde Nuri Paşa Konağına taşınan Dârülfünûn, kısa bir süre sonra çıkan yangında kütüphane ve laboratuarı yanınca, eğitime ara vermek zorunda kaldı. Maarif Nâzırı Safvet Paşa'nın gayretleriyle, Türbe’de ikinci bir Dârülfünûn binası yaptırıldı. 1870’te açılan okulun ilk rektörü Yanyalı Hoca Tahsin Efendi olmuştur. Kısa bir süre sonra, karışıklıkların merkezi olması sebebiyle, bu okul, 1871’de kapatıldı.

1896’da Sadrazam Said Paşa'nın Sultan İkinci Abdülhamid Han'a sunduğu bir lâyiha ile Dârülfünûn’un tekrar tesisine başlanmış, fakat Osmanlı-Yunan savaşının çıkmasıyla, iş yine tehir edilmişti. 1 Eylül 1900’de Sultan İkinci Abdülhamid Han'ın isteği ile Dârülfünûn-ı Şahâne adıyla tekrar tesis edildi. Mülkiye, Hukuk, Tıbbiye mekteplerinin yanına Ulûm-ı Aliyye-i Dîniyye, Edebiyat, Ulûm-i Riyâziye ve Tabiiye kolları ile Türkçe, Arapça, Farsça'dan başka Fransız, Alman, İngiliz ve Rus filolojilerini toplayan bir bölüm ilave edildi. Yeniden kurulan okulda, yerli hocalardan başka Avrupalı hocalar da ders veriyordu.

İkinci Meşrutiyet'ten sonra, 21 Eylül 1908’de, Vezneciler’deki Zeyneb Hanım Konağına taşındı ve program yeniden düzenlendi. 1912’de Lüleburgazlı Emrullah Efendinin hazırladığı programla, Dârülfünûn’un, modern üniversite hâline getirilme çalışmalarına başlandı. Zeyneb Hanım Konağının yeterli olmamaya başlamasıyla, Yerebatan’da Kimya, Feyzullah Efendi Konağında Jeoloji, İbrahim Paşa Konağında Doğu Dilleri ve Safvet Paşa Konağında Coğrafya Enstitüleri tesis olundu.

Birinci Dünya Savaşı esnasında, Almanya’dan, edebiyat, fen ve hukuk fakülteleri için davet edilen profesörler ile öğretim kadrosu güçlendirildi. Savaştan sonra, yeni bir yönetmelik hazırlandı. Buna göre, Dârülfünûn’u her yıl seçilen bir rektörün (emin) başkanlığı altında, fakülte temsilcilerinden meydana gelen bir dîvân (senato) idare edecekti. Yine bu yönetmeliğe göre, dört medrese (fakülte) bulunacaktı: Edebiyat, Hukuk, Tıb ve Fünûn.

Cumhuriyetin ilanından sonra Dârülfünûn’a, eski Harbiye Nezâreti binası (İstanbul Üniversitesi merkez binası) öğretim için verildi ve ilk rektör İsmail Hakkı Baltacıoğlu oldu. 1924’te çıkan kanunla, Dârülfünûn’a hükmî şahsiyet (tüzel kişilik) verildi. 31 Mart 1933 tarihli ve 2252 sayılı Üniversite Kanunu ile Dârülfünûn lağvedilmiş ve yeni üniversite kurma işi, Maarif Vekâletine (Millî Eğitim Bakanlığı) verilmiştir.